Wie auch in Super Mario Bros. und Super Mario Bros. 3 besteht die Hauptaufgabe darin, Prinzessin Peach aus den Klauen von Marios Erzfeind Bowser zu befreien. Dazu müssen sich die Protagonisten, Mario und Luigi, durch acht miteinander verbundene Welten und deren Levels kämpfen. Am Ende jeder Welt gibt es einen Endgegner
Yoshi und seine Kameraden wurden von Bowser und seinen Helfern in die Blöcke gesperrt und warten nun darauf, befreit zu werden Die Levels bieten einen kontinuierlich steigenden Schwierigkeitsgrad und sind über die Weltkarte erreichbar. Gelbe Punkte symbolisieren normale Level. Rote Punkte bieten einen alternativen Ausgang, wie ein zweites Tor oder einen Schlüssel. Alle Welten sind mit Pfaden untereinander verbunden. Um ein neues Level freizuschalten, muss der Spieler das vorhergehende erfolgreich absolvieren